人骨髓来源细胞外基质对人牙周膜干细胞增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.019

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (6): 938-943.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.019

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人骨髓来源细胞外基质对人牙周膜干细胞增殖的影响

王阿娴，唐丽，梁源，季海宁，武俊杰，丁寅

解放军第四军医大学口腔医院正畸科，陕西省西安市 710032

修回日期:2013-12-26 出版日期:2014-02-05 发布日期:2014-02-05
通讯作者: 丁寅，博士，教授，解放军第四军医大学口腔医院正畸科，陕西省西安市 710032 武俊杰，博士，讲师，解放军第四军医大学口腔医院正畸科，陕西省西安市 710032
作者简介:王阿娴，女，1987年生，陕西省汉中市人，汉族，解放军第四军医大学在读硕士，医师，主要从事口腔正畸临床及细胞外基质基础的研究。
基金资助:
2011年国家自然科学基金青年科学基金项目(81100750)

Effects of human bone marrow cells-derived extracellular matrix on the proliferation of human periodontal ligament stem cells

Wang A-xian, Tang Li, Liang Yuan, Ji Hai-ning, Wu Jun-jie, Ding Yin

Department of Orthodontics, Hospital of Stomatology, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Revised:2013-12-26 Online:2014-02-05 Published:2014-02-05
Contact: Ding Yin, D.D.S., Ph.D., Professor, Department of Orthodontics, Hospital of Stomatology, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China Wu Jun-jie, D.D.S., Ph.D., Lecturer, Department of Orthodontics, Hospital of Stomatology, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
About author:Wang A-xian, Studying for master’s degree, Physician, Department of Orthodontics, Hospital of Stomatology, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China for the Youth in 2011, No. 81100750

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现人来源的骨髓细胞外基质能促进人牙周膜干细胞增殖并保持干细胞的特性。

目的：初步观察人骨髓来源的细胞外基质对人牙周膜干细胞增殖能力影响。

方法：分离人正常牙周膜细胞及颌骨骨髓细胞，制备骨髓细胞外基质膜片。采用有限稀释法克隆培养纯化人牙周膜干细胞，透射电镜观察细胞超微结构。取P2代人牙周膜干细胞与骨髓细胞来源细胞外基质共同培养，以普通培养基对照，采用CCK8法及细胞周期流式技术检测人骨髓细胞来源细胞外基质对人牙周膜干细胞增殖能力的影响。

结果与结论：实验组人牙周膜干细胞较对照组相比细胞增殖能力显著增强(P < 0.05)，且细胞符合其生物学形态及生物学特性，生长状态良好。说明实验建立起的骨髓细胞外基质能够促进牙周膜干细胞的增殖，是一种扩增干细胞的有效方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 培养, 骨髓细胞, 细胞外基质, 牙周膜干细胞, 增殖, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Human bone marrow cells-derived extracellular matrix can promote proliferation of human periodontal ligament stem cells and maintain stem cell properties.

OBJECTIVE: To preliminarily investigate the effect of human bone marrow cells-derived extracellular matrix on the proliferation of human periodontal ligament stem cells.

METHODS: Human periodontal ligament stem cells and bone marrow cells were separately derived from human periodontal tissue and jaw bone marrow, and human bone marrow cells-derived extracellular matrix was prepared. Human periodontal ligament stem cells were cultured and purified using limited dilution cloning method, and transmission electron microscope was used for ultrastructure observation. Human periodontal ligament stem cells at passage 2 were cultured with human bone marrow cells-derived extracellular matrix and normal culture medium (control group). The cell counting kit-8 and flow cytometry were used to determine the proliferation potential of human periodontal ligament stem cells cultured on human bone marrow cells-derived extracellular matrix.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, human periodontal ligament stem cells cultured on human bone marrow cells-derived extracellular matrix had a superior capacity of proliferation (P < 0.05), and the cells met their morphological and biological characteristics, and grew in good conditions. Human bone marrow cells-derived extracellular matrix is a promising matrix for large-scale expanding human periodontal ligament stem cells for future use in stem cell-based therapy.

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Key words: stem cells, extracellular matrix, periodontal ligament

中图分类号:

R394.2

王阿娴，唐丽，梁源，季海宁，武俊杰，丁寅. 人骨髓来源细胞外基质对人牙周膜干细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(6): 938-943.

Wang A-xian, Tang Li, Liang Yuan, Ji Hai-ning, Wu Jun-jie, Ding Yin. Effects of human bone marrow cells-derived extracellular matrix on the proliferation of human periodontal ligament stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(6): 938-943.

图/表（结果） 2

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引言

人体组织内成体干细胞的动态平衡及其分化是组织器官再生修复的生物学基础^[1-2]，而成体干细胞的增殖和分化除了受到内在因素的调控外，还受到其所处外在微环境的重要影响。

牙周膜作为一种高度纤维化和血管化的结缔组织，其在体内具有惊人的更新能力。因此有学者很早就提出存在于牙周组织中的3种主要细胞即成牙骨质细胞、牙周膜成纤维细胞和牙槽骨细胞均可能来自于共同的祖细胞。

McCulloch等^[3]研究发现牙周膜中存在这一类的祖细胞，其分布接近血管组织且具有干细胞的一些特征，这是最早的牙周膜中存在干细胞的证明。

此后，施松涛等^[4]首次在体外通过单克隆分选和磁珠分离法分选出人牙周膜干细胞，并进行了全面的鉴定。由此鉴定出的牙周膜干细胞已被认为是具有多向分化潜能的细胞群体，在维持牙周关系稳定、细胞动员储备及促进牙周再生中具有重要意义。此项研究发现，牙周膜干细胞具备间充质干细胞的特点，如克隆形成性、高增殖性、表达干细胞标志基质细胞抗原1和血管周细胞标志CD146以及多向分化能力。

通过体内移植实验表明，牙周膜干细胞可以生成牙骨质/牙周膜样结构，并可以修复免疫缺陷大鼠的牙周缺损。并且发现，可以从冻存的牙周膜组织中分离出牙周膜干细胞，所分离出的细胞与正常获得的牙周膜干细胞性质相同^[5]，从而为今后的临床实际应用提供了更为可行的方法。

通过王松灵教授课题组建立的小型猪牙周炎模型^[6]，发现自体来源和同种异体来源牙周膜干细胞均可以参与牙周组织缺损的再生修复^[7]，为治愈牙周炎带来了希望。然而，基质细胞抗原1⁺CD146⁺的牙周膜干细胞仅占全体牙周膜细胞的2.6%^[8]，将牙周膜干细胞用于临床牙周组织再生也应首先要保证能够获得足够数量的细胞，以往的研究难以大量扩增牙周膜干细胞^[9-10]，这也成为了亟待解决的问题。

此外，基于干细胞增殖受到微环境的影响^[11-14]，近年来，陈晓东等^[15-19]学者在细胞外基质对骨髓间充质干细胞的作用方面开展了系统、深入的研究，建立起了生产大量细胞外基质的独特方法和成熟体系，并经过了大量体内体外实验充分验证起作用。

首先研究了小鼠骨髓细胞来源的细胞外基质^[20]。并发现，与普通培养相比，该细胞外基质可以促进小鼠骨髓间充质干细胞增殖，同时保持细胞的骨向、脂向分化能力，体内移植实验结果显示在细胞外基质上培养的小鼠骨髓间充质干细胞生成的骨量和骨髓量分别比对照组增加了5倍和8倍。基于以上他们进一步研究了人骨髓细胞来源细胞外基质对于人骨髓间充质干细胞的作用，发现人来源的骨髓细胞外基质不仅能够促进细胞增殖，保持了干细胞特性^[21]。

由于牙周组织微环境对于牙周膜干细胞的影响仍未明确，同时，在以往研究中，来源于牙槽骨周围的牙周膜干细胞被认为由于其接触的是骨组织微环境，所以表现出较强的成骨特性，参与牙槽骨的改建与再生。而且，通过已发表的文献也发现往往只是研究细胞外基质中某种特定的成份对于牙周膜细胞的影响^[22]。

为了探究微环境与牙周膜干细胞之间的关系，实验建立起人颌骨骨髓细胞来源细胞外基质模型来模拟牙周组织骨髓微环境，探讨其对人牙周膜干细胞的增殖作用的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2013年3至10月在解放军第四军医大学口腔颌面外科实验室完成。

材料：

实验方法：

人牙周膜细胞培养：收集临床12-18岁因正畸需要而拔除的牙周健康、无龋的新鲜前磨牙(患者对治疗均知情同意)，PBS洗3次，刮取根中1/3牙周膜组织，采用酶解组织块法培养，每隔3 d换液，直至细胞从组织块周围游出，细胞生长达80%汇合时传代。

人牙周膜干细胞表型鉴定：人牙周膜干细胞表型分析参考文献[23]的方法进行。

人骨髓细胞培养：经解放军第四军医大学校口腔医院伦理委员会批准，患者知情同意后，选取5例正颌手术患者(排除其他系统性疾病和骨质疏松)，在术中抽取骨髓5 mL，置于枸橼酸锂抗凝管中。在超净台内将骨髓与等体积的不含血清的低糖α-MEM培养液(青霉素钠100 U/mL和链霉素 100 U/mL)混合，用吸管反复吹打使骨髓组织基本均匀分散。室温400×g离心10 min，去掉脂肪层，用低糖α-MEM培养液重悬细胞，缓慢注入预先加入等体积的1.073 g/mL的Percoll分离液的离心管内，注意保持液体分界面完整(Percoll分离液位于下方，而稀释血液位于上方)，400×g离心30 min，吸取中间的单个核细胞层，PBS洗2次重悬于含体积分数10%胎牛血清的低糖α-MEM养液(含青霉素钠 100 U/mL和链霉素100 U/mL)，调整细胞浓度为1×10⁹L^-¹，接种于25 cm²的培养瓶中，置于CO₂孵箱中孵育。24 h后换液去除未贴壁细胞，以后每3 d换液，倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。待细胞生长至80%-90%融合时，用 2.5 g/L胰酶消化按1∶2比例传代培养。

人骨髓来源细胞外基质模型构建：取P3代人骨髓细胞以2×10⁷ L^-¹浓度接种于培养瓶及六孔板中，每3 d左右换液，第7天加VC液(50 μmol/L)诱导基质分泌。第14天进行脱细胞处理：PBS轻洗后，加含1%Triton X-100，20 mmol/L NH₄OH的PBS，放置5 min，37 ℃。之后PBS反复洗脱4次。用含二性霉素、青霉素、链霉素的PBS 4 ℃冰箱保存。

有限稀释法克隆培养纯化人牙周膜干细胞^[21]：将上述收集的对数生长期牙周膜细胞的培养上清按1 500 r/min离心10 min，经0.22 µm 直径的滤器过滤后，与培养基以1∶1比例混合作为适应性培养基。取对数生长期的第1代细胞用适应性培养基倍比稀释，调整细胞密度至(10-15)× 10³ L^-¹，吹打混匀，接种于96孔培养板中，100 µL/孔，培养12 h后标记单个细胞贴壁的孔，并补液至200 µL/孔，5 d后换液，光镜下观察克隆形成情况。常规培养7-14 d，至出现细胞克隆(细胞数≥50为判定标准)，待克隆长至孔底1/3-1/2后胰酶消化，转移至24孔板扩大培养后保存，以此获得纯化的牙周膜干细胞。

透射电镜细胞超微结构观察：在六孔板中构建人骨髓来源细胞外基质模型，于第14天脱细胞处理后，用2%戊二醛PBS固定液固定样本2 h，收集基质膜片，经漂洗、固定、置换、浸透、包埋、切片，以枸橼酸铅电子染色，JEM-1400透射电子显微镜观察模型超微结构。设同等条件下培养细胞但未经脱细胞处理的六孔板内的细胞膜片为对照组进行观察。

流式细胞周期分析人牙周膜干细胞的增殖能力：取对数生长期P3代人牙周膜干细胞，消化制备单细胞悬液，以2×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于75 cm²的两组培养瓶中，于 37 ℃，体积分数5%CO₂的孵箱中共同培养。实验分为两组，实验组以经特殊构建的人骨髓细胞来源细胞外基质模型为培养条件，并设未经特殊构建的普通培养条件为对照组。待细胞7 d基本长满后，消化细胞，加1 mL PBS吹打形成单细胞悬液，后加入预冷的无水乙醇2 mL吹打混匀，4 ℃过夜，离心弃乙醇，PBS洗，加入5 mL/L的PI (碘化丙锭)1 mL，4 ℃染色30 min，过300目的尼龙筛网，送流式细胞仪上机，进行细胞周期检测。细胞周期分布以增殖指数(PI；处于S期和G₂/M期的细胞百分比)表示。

CCK8法检测人骨髓细胞来源细胞外基质对人牙周膜干细胞增殖能力的影响：取生长对数期的P2代人牙周膜干细胞，设普通75 cm²培养瓶为对照，以2×10⁸L^-¹细胞浓度接种于同等大小以构建骨髓细胞来源细胞外基质模型作为培养条件的培养瓶中(实验组)，并共同培养于37 ℃，体积分数5%CO₂条件的孵箱中。7 d后分别胰酶消化。细胞计数后，调整细胞密度为2×10³/孔接种于96孔板，每孔加入液体100 µL，共接种48个孔，培养过夜。次日更换培养液，待测孔加入100 µL CCK8液，每次测量12个孔，孵箱培养4 h。4 h后酶联免疫检测仪450 nm出测量12个孔吸光值去平均值。次日重复测量，连续测量7 d，重复3次。

主要观察指标：流式细胞周期分析检测细胞增殖指数S+G₂M(增殖指数：PI)；CCK8实验通过检测细胞生长曲线以检测其增殖能力。

统计学分析：采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。计量数据以x(_)±s表示，采用配对t 检验，P < 0.05表明差异有显著性意义。

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讨论

牙周炎是由牙菌斑中的微生物所引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病，可以导致牙周支持组织的炎症、牙周袋形成、进行性附着丧失和牙槽骨吸收，最终造成牙齿松动以及被拔除。目前，牙周炎在中国的患病率已超过80%，是中国成年人丧失牙齿的首位原因。同时，牙周炎还是全身系统性疾病例如糖尿病、心血管疾病的重要危险因素^[24]。但正常的牙周组织一旦遭到炎症破坏，则难以自愈。现有的治疗方法都存在各自的局限性^[25]，尚不能实现理想的牙周再生和完全恢复牙周组织结构。

牙周组织由于存在于牙-牙周-牙槽骨-颌骨相关的特殊部位，有其精细复杂的结构。而牙周膜干细胞存在于这样一个狭小却关联甚广的空间，发育及功能调控必然受到多方面的作用。然而，牙周膜干细胞被认为是牙周组织稳定和修复再生的细胞学基础，这使得利用干细胞治疗解决牙周炎组织缺损成为可能^[26]。

从实验室向临床转化就必将面临两个重要瓶颈，一是临床治疗需要大量的牙周膜干细胞，而该细胞组织来源有限，同时，间充质干细胞在普通培养条件下扩增，随着代数增加，细胞会发生老化或分化，逐渐失去其自我更新和多向分化的干细胞特性^[26-28]。怎样快速、高质量地扩增出满足临床需要的干细胞是急需解决的问题。二是牙周组织是复杂型组织。

解决以上问题有两种途径，第一是通过基因修饰、RNA 干扰等技术直接控制牙周膜干细胞的增殖和分化，即将基因治疗和干细胞治疗两种先进手段结合起来，但是在未来的临床应用中必须考虑其安全性的问题；第二是通过“外因”来影响牙周膜干细胞，即通过干细胞所处的微环境来调控其增殖分化。干细胞与微环境之间的相互作用，一直是当前干细胞领域的需要解决的重要科学问题。干细胞具有自我更新和多向分化两大特性，而微环境对于干细胞的维持和分化发挥着重要的调控作用^[13-14^，^29]。该方面的研究常见于针对果蝇生殖腺、脊椎动物毛囊、骨髓和脑室下区等。目前，牙周组织微环境对于牙周膜干细胞的影响还尚未明确。

众所周知，微环境作为细胞在体内赖以生存的局部条件，控制着细胞的增殖、分化，其概念是指由能够近距离调控细胞兴奋或抑制其活动的微量理化和生物因素，以及细胞在进化和分化过程中形成的、对相关因子敏感的特殊结构和受体所组成的综合性机能环境。其中，细胞基质微环境是指位于生物体内细胞外空间中、由细胞分泌的蛋白质和多糖所构成的网络结构总称。它或者以细胞外间质的形式充填于细胞与细胞之间构成细胞间黏合质，或位于结缔组织内构成其重要组成部分，或者以基底膜形式位于上皮与结缔组织交界区，对于细胞的附着、增殖和分化能够产生重要影响。

这种细胞来源基质微环境主要包括了基质的化学组成和物理性能。形态可以说是发挥功能的基础，研究表明，基质的物理性能能够影响细胞的状态。Engler等^[30]研究发现基质的弹性模量能够指导间充质干细胞发生定向分化，例如类似于脑组织的软基质可诱导干细胞向神经细胞分化，类似于肌肉组织的基质可诱导干细胞向肌细胞分化，而类似于骨组织的硬基质则诱导干细胞向成骨细胞分化。由此，推测牙周膜组织独特的细胞外基质，结构与成分对于牙周膜干细胞有着直接而重要的调控作用。

根据前期关于人骨髓来源细胞外基质对人骨髓干细胞的研究，已经发现人骨髓来源的细胞外基质可以明显促进骨髓干细胞的增殖并保持其干细胞特性。值得一提的是，牙周组织干细胞及其微环境因其部位特殊性^[31]，被认为存在着类似骨髓间充质干细胞成骨的骨组织微环境，即牙周组织特异性基质微环境的作用不仅来源于牙周膜组织，也来源于骨组织。

基于大量的前期研究结果，实验建立起独特的人颌骨骨髓来源的细胞外基质模型来模拟牙周微环境中的细胞基质微环境。作者将这种微环境作为切入点，来综合探讨其对牙周膜干细胞的影响，期望在回答微环境与干细胞关系的理论问题的同时，能够为解决临床实际问题提供新的方法和思路。

实验首次探讨了人颌骨骨髓基质微环境对于人牙周膜干细胞增殖能力的影响。文章采用独特方法，以人颌骨骨髓来源细胞外基质模拟骨髓微环境，发现实验组人牙周膜干细胞细胞周期及生长曲线结果明显优于对照组。

细胞周期分析一直是反映细胞增殖动力学的重要参考指标。G₀期的细胞处于静息状态，而G₁期是细胞为过渡至S期作准备，发生的是与DNA合成有关的生理变化；S期细胞发生的是DNA合成和复制，增殖旺盛的细胞处于S期的比例较高；G₂期为DNA合成后期、细胞分裂前期，M期为细胞有丝分裂期。

细胞分裂相的多少可作为细胞增殖情况判断的指标，S+G₂M(增殖指数：PI)就代表了群体中增殖期细胞的数量。同时，Cell Counting Kit-8简称CCK8试剂盒，作为广泛用于应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒，相比较常用的MTT检测法，也具有灵敏度高，操作简单，检测时效短，细胞毒性小等优势，通过用酶联免疫检测仪在 450 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，检测细胞增殖能力，颜色的深浅与细胞的增殖成正比。

通过以上两种分析，结果显示，与普通培养条件下相比，经有效分离后的人牙周膜干细胞在人骨髓细胞所制备的细胞外基质界面上生长特性上明显改变^[32-35]，而且都表现出了高增殖性，也就是说，人骨髓来源的细胞外基质明显促进了人牙周膜干细胞的增殖。同时，透射电镜已显示经特殊制备的细胞外基质的结构主要有胶原构成，内部无细胞核及细胞器细胞残留。进一步说明细胞外基质的成分及结构在促进细胞增殖能力上起到了决定性作用。

作者推断，细胞外基质之所以能够发挥这样的作用其机制可能有两点：第一，细胞外基质能够暂时“绑定”细胞分泌的内源性生长因子如骨形态发生蛋白2等，起到缓释效果，从而使细胞获得充足的增殖时间，并对外源性生长因子保持高度的敏感性；第二，经此构建的细胞外基质并未破坏原有的胶原结构，而其排列如同有序排列的“轨道”，细胞在此界面上可以沿“轨道”迁移，就少发生“碰撞”，减少了接触抑制，从而促进了细胞增殖，降低了分化的几率。那么，细胞外基质介导的细胞比正常细胞表现出更强的有丝分裂能力。由于微环境相关机制复杂，还需要进一步的深入研究。但是有一点比较明确，即是任何单一因素都不能靠单独发挥作用而完全实现理想的牙周再生，必须考虑综合因素例如生长因子及其它细胞分化的影响^[36-39]。

综上所述，实验通过简单有效的方法构建牙周微环境骨基质模型，发现人骨髓来源的细胞外基质能够明显促进人牙周膜干细胞增殖。结果证明，牙周膜组织独特的骨髓细胞外基质结构与成分对于牙周膜干细胞有着直接而重要的调控作用。本研究提示可以通过构建及调节牙周特殊微环境，来提高牙周膜干细胞的增殖能力，为今后临床应用奠定基础。

人骨髓来源细胞外基质对人牙周膜干细胞增殖的影响

Effects of human bone marrow cells-derived extracellular matrix on the proliferation of human periodontal ligament stem cells

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